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    GB4789.3-2016 大腸菌群計數(shù)及注意事項

    發(fā)布時間: 2024-04-17  點擊次數(shù): 720次

    01

    大腸菌群定義和衛(wèi)生學(xué)意義


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    大腸菌群定義:

    在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名,它不代表某一種或某一屬的細(xì)菌,而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括:埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬(又叫產(chǎn)氣桿菌屬,包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌)和等。

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    衛(wèi)生學(xué)意義:

    大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評價樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的程度。

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    02

    GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法

    1


    什么是MPN法?

    MPN法是統(tǒng)計學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的zui低稀釋度與生長的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。

    MPN值并不能表示實際菌落數(shù),實際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點,MPN值是落在這個置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點。

    靈敏度較高,適用于污染菌落較少的樣品。

    2


    大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗操作

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    操  作  注  意  事  項

    1

    建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液,因為磷酸鹽緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化,對細(xì)菌具有保護(hù)作用。

    2

    初發(fā)酵接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯。

    3

    培養(yǎng)基檢查。加入樣品前應(yīng)觀察導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡,若有,應(yīng)適當(dāng)傾斜試管,讓氣體排出。

    4

    結(jié)果觀察。某些食品樣品可能會堵塞小導(dǎo)管底部,影響導(dǎo)管內(nèi)氣泡的觀察,可將試管微微傾斜,用手指輕彈管壁,觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起,若有,則判定產(chǎn)氣。


    3


    培養(yǎng)基原理解析

    月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)

    ? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長,胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。

    ? 36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣,則可停止培養(yǎng)。如果沒有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象,則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。

    ? 如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯。

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    煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)

    ? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。

    ? 培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽,大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會與膽鹽發(fā)生反應(yīng),形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色。

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    4


    大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)報告

    確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù),檢索MPN表,報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值

    當(dāng)實驗結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時,如:陽性管數(shù)為122,123,232,233等時,建議增加稀釋度(可做4~5個稀釋度),使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(如果污染程度不能判定,則多加一稀釋度),然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找,最終確定MPN值。

    表B.1

    大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表

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    03

    GB4789.3-2016大腸菌群計數(shù)平板法

    1


    大腸菌群平板計數(shù)法流程圖

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    操  作  注  意  事  項

    1

    平板法相對MPN法來說,結(jié)果更加直觀精確。長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2~3或更多個細(xì)胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。適用于污染較為嚴(yán)重的樣品。

    2

    從一個樣品取樣到傾注瓊脂平板,應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成。

    3

    檢驗所用物品應(yīng)無菌,無抑菌殘留物。

    4

    BGLB確證試驗需從VRBA平板上挑起至少10個典型和可疑菌落進(jìn)行,如平板上菌落數(shù)少于10個,則挑取全部典型和可疑菌落進(jìn)行確證。


    2


    培養(yǎng)基原理解析

    結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)

    ? 配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌,中性紅作為指示劑,在酸性條件下為紫紅色。

    ? 大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合,可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。

    ? 該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌,現(xiàn)配現(xiàn)用。

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    3


    計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)

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    大腸菌群定義:

    選取菌落數(shù)在15CFU~150 CFU之間的平板,分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm或更大。

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    證實試驗:

    從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內(nèi),36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣,即可報告為大腸菌群陽性。

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    大腸菌群平板計數(shù)的報告

    經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:

    100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。

    若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計算。

    04

    質(zhì)量控制

    實驗室過程中,每批樣品稀釋液都要做空白對照。

    為了控制環(huán)境污染,每次檢驗過程中,于檢驗臺上打開兩塊計數(shù)瓊脂平板,并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘,將此平板與本批次樣品同時進(jìn)行培養(yǎng),以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

    定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品,在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi),用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽性實驗驗證,并進(jìn)行記錄,次驗證實驗至少每2個月進(jìn)行1次。

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    05

    大腸菌群測試片法

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    1


    原理

    大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐,其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層(營養(yǎng)物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑)和透明隔水膜組成,經(jīng)輻照滅菌??捎糜谑称?、飲料等的大腸菌群計數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。

    2


    培養(yǎng)基原理解析

    菌落計數(shù)特別方便(容易判讀),紅色菌落,易于食品顆粒分開,無菌落重疊現(xiàn)象;

    菌落分布特別均勻;

    避免了培養(yǎng)基對細(xì)菌熱損傷有關(guān);

    菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生;

    經(jīng)濟(jì)環(huán)保無粉塵,體積小,重量輕,易儲運;

    保質(zhì)期長干制無水培養(yǎng)基,性質(zhì)穩(wěn)定,保質(zhì)期更長。

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    使用說明

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    所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株

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    專注微生物監(jiān)測控制,為食藥安全保駕護(hù)航

    微生物監(jiān)測控制整體解決方案的提供者



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