傳統(tǒng)的菌種保存方式簡介

•   斜面保存法：微生物保存基本的方法，可廣泛用于細(xì)菌、真菌等，保存期限非常短，斜面容易干裂。

•   液體石蠟保存法：可用于保存霉菌、酵母菌、放線菌及需氧菌，方法簡便，可防止斜面干燥和氧氣進(jìn)入，但一些固氮菌、分枝桿菌、毛霉、厭氧菌等不適宜用此法。

•   甘油冷凍保存法：用于一般細(xì)菌的保存，需使甘油終濃度為20%左右，然后-20℃或-70℃以下保存。融化時需要水浴溶化。

•   真空冷凍保存法：具有低溫、干燥、無氧的保存條件，適用于98%以上菌種的保存，但操作復(fù)雜，一般實驗室難以使用。

•   液氮保存法：基本所有微生物均可保存，并且保存時間長，但操作較為復(fù)雜而且需要設(shè)備，不適用于一般實驗室保存菌種。

•   沙土保存法

•   半固體保存法

瓷珠菌種保存法的原理

瓷珠菌種保存管是實驗室保存菌種的容器，管內(nèi)有表面凹孔小瓷珠用于細(xì)菌的吸附和保存，放置于-20℃或-80℃下便可創(chuàng)造干燥、低溫、缺營養(yǎng)的環(huán)境，使菌株處于“休眠” 狀態(tài)，方可長期保存（視不同菌種與保存溫度，一般可保存3-10 年）, 同時菌種保存管的取用和保存較為便利（取用復(fù)蘇及保存菌種僅需1分鐘）。

瓷珠菌種保存管的優(yōu)點

•      用途：菌種保存、復(fù)蘇和運(yùn)輸。

•      優(yōu)點：操作簡單方便、菌種保存快速、包裝物體積小、菌種保存時間長。

•     操作簡單方便：挑取細(xì)菌新鮮純培養(yǎng)物，接入菌種保存管。

•     菌種保存快速：混勻后，吸出冷凍保存液。

•     包裝物體積小：1.8ml冷凍管。

•     菌種保存時間長：2-8℃可保存6個月；-20℃可保存12個月；-80℃可保存24個月。

瓷珠菌種保存管的使用方法

菌種保存流程

1.從培養(yǎng)18h以上的平板上刮去新鮮純培養(yǎng)物于菌種保存管中，配成大約3-4麥?zhǔn)媳葷岫鹊木鷳乙骸?/p>

2.擰緊保存管，來回顛倒幾次使細(xì)菌乳化，不能旋搖。

3.用無菌移液器將菌種保存管內(nèi)的液體吸取干凈，妥善放置被吸出的液體。

4.擰緊保存管，迅速將其置于-20℃或-70℃冰箱中。

使用時的注意事項

•   被保存的菌種要求是經(jīng)過純化后培養(yǎng) 18-24h 內(nèi)的新鮮菌種（細(xì)菌18-24h，酵母菌需3 天，形成孢子的微生物保存孢子，而放線菌和絲狀真菌需培養(yǎng)7 天后保存），不宜使用老化或未經(jīng)鑒定的菌種。

•   菌種保存濃度必須要做3-4 麥?zhǔn)媳葷岫龋缃臃N濃度過低將會降低復(fù)蘇效果。

•   待保存于菌種保存管中的菌種*乳化均勻吸附在多孔小瓷珠后，要將多余的菌種保存液吸取出來并棄之，否則在復(fù)蘇時的凍融過程中會損傷菌株活性。

•   做厭氧菌保存時，應(yīng)提供厭氧的環(huán)境，如厭氧箱、厭氧袋，菌種保存管中可通入氮?dú)鈦眚?qū)除保存菌種時所引入的氧氣。菌種復(fù)蘇時，也要創(chuàng)造厭氧的環(huán)境。

•   菌種復(fù)蘇完成后，對使用菌株需要進(jìn)行再次純化，以保證菌株的單一性。

常見問題答疑

1、菌種保存管能保存霉菌及酵母菌嗎？

答：可以。對于霉菌等真菌需培養(yǎng)7 天進(jìn)行保存，而酵母菌需培養(yǎng)三天將孢子洗脫下來進(jìn)行保存，保存管中的小瓷珠可以作為介質(zhì)來吸附孢子和菌絲，相當(dāng)于砂土保存法中砂土作為載體起到的作用。

2、所有的菌都能保存嗎？如果不是的話，什么樣的菌可以保存？什么樣的菌不可以保存？

答：可以。菌種保存的原理是預(yù)防或減緩DNA 復(fù)制時自發(fā)突變導(dǎo)致菌種退化，因此要創(chuàng)造代謝不活潑的狀態(tài)，而菌種保存時使菌種進(jìn)入休眠態(tài)（孢子、芽孢)，并創(chuàng)造干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)的環(huán)境，創(chuàng)造的環(huán)境越接近此狀態(tài)，所保存的菌種的時間就越長，所以從原理上講，所有菌種都可用這種方法保存， 但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血桿菌、腦膜炎萘瑟氏菌）等特殊細(xì)菌保存時，需-80℃或更低溫度保存，才可以做到更長期的保存。

3、能用菌種保存管長久保存菌株嗎？

答：溫度越低，保藏效果越好。從目前的試驗數(shù)據(jù)及實際保存效果來看，-20℃可保存1-5 年，-80℃或液氮中可保存5-10 年，不同菌種及不同的保存溫度保存時間會有所不同（例如：大腸、沙門等常規(guī)細(xì)菌-20℃我們目前可以保存到6年）。但需要注意的是所保存的菌種需每年抽檢進(jìn)行生化特征的鑒定，確定菌株無變異。

4、菌種保藏時為什么要進(jìn)行分離純化？

答：分離純化后才能獲得單一菌株，單一菌株進(jìn)行菌種保藏才有意義，防止菌種交叉污染和變異，這也是菌種保存的基本原則。

5、菌種保存管對于平板來說，對挑選菌落個數(shù)有要求嗎？還是將整個平板的菌落全部刮入管中？

答：對于要保存的細(xì)菌一般是要進(jìn)行2-3 次的純化，要保證一個平板上的菌是由單一菌落傳代而來的，所以在細(xì)菌保存的過程中，為了保證制備的菌懸液可以達(dá)到3-4MCF，是可以將整個平板的的細(xì)菌全部刮到管中的，如果平板長的比較滿一般半個平板就夠用，具體用量也根據(jù)菌種的不同有所差異，如霉菌、酵母菌在保存時，不適合用濁度法。

6、對于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的純菌，是否也可以用咱們的菌種保存管？如果可以的話，怎么操作？

答：是可以用的，如果液體培養(yǎng)基能保證是純菌的話，可以直接離心，棄掉上清，然后把保存管中液體吸進(jìn)去充分混勻，然后再轉(zhuǎn)移到菌種保存管中，整個過程要注意無菌操作。不過，一般菌種保存管選擇平板菌落進(jìn)行保存，因為液體培養(yǎng)基中有雜菌是不易觀察出來的。

7、為什么在菌種保存時，要上下顛倒？為什么不能旋搖？

答：上下顛倒，可使菌懸液充分混勻，菌株充分、均勻地吸附到小瓷珠上，旋搖不利于菌懸液充分混勻,反而會使菌株全部沉淀于管底。

8、為什么在使用時要將管內(nèi)的液體盡可能多的吸出？

答：吸出液體可避免反復(fù)凍融形成的冰晶對菌株的損傷，加快復(fù)蘇的過程，因此，要盡可能的將與菌種混勻后的保存液吸凈。而常用的甘油法，在復(fù)蘇的過程中需用水浴鍋快速溶解，在此過程中，對菌株傷害較大。

9、在使用后，菌種保存管的保存環(huán)境？需要-80℃冰箱嗎？

答：本公司菌種保存管采用的是低溫冷凍保存法，因此，使用后，需放置低溫環(huán)境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且溫度越低，保存效果越好。用戶需根據(jù)菌種的保存要求選擇具體保存溫度。

10、為什么說，如果有條件的話，菌種保存管置于-80 冰箱或液氮中？

答：因為，貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成，可極大降低冰晶形成對細(xì)菌的傷害，同時可為被保存的菌種創(chuàng)造更低的代謝環(huán)境，從而延長細(xì)菌保存的時間。

11、為什么在取用菌株時，操作過程要求快速？

答：菌種保存復(fù)蘇的原則，要求慢凍快融，之所以要求快速，是因為在菌種復(fù)蘇的過程中, 長時間的溶解過程會對所保存的菌種造成損傷，而我們經(jīng)過改良的保存方法很程度的避免復(fù)蘇所造成的影響，但我們還是建議遵循菌種的保存復(fù)蘇原則，保證所復(fù)蘇菌種的復(fù)蘇率。

12、將菌株反復(fù)凍存，到底對菌株有什么影響？

答：低溫會使菌株細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞膜的損傷。細(xì)胞體積大者一般要比較小者對低溫更為敏感，而無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁者敏感。如果放到低溫（不是一般冰箱）進(jìn)行冷凍時，會產(chǎn)生冰晶，冰晶呈針狀，極易導(dǎo)致細(xì)菌的嚴(yán)重?fù)p傷。用電鏡觀察，可見細(xì)菌的核膜上有大量針尖樣小孔，當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會變大，故反復(fù)凍存，會對菌株造成極大損傷。

13、為什么有時候菌種的保存效果不佳？

答：1、可能是由于保存后未將保存液吸盡，反復(fù)凍融形成冰晶損傷菌株細(xì)胞，影響了菌株活性。

2、確定所保存的菌種是否為對數(shù)生長期的菌種，我們建議普通菌種保存為18小時內(nèi)的新鮮菌種，而霉菌需要待孢子出現(xiàn)后保存其孢子。

14、該產(chǎn)品能否用于菌種的運(yùn)送，如果可以在什么條件下運(yùn)送？

答：就目前試驗數(shù)據(jù)而言，我們建議可主要用于普通細(xì)菌的短期運(yùn)送，對于厭氧菌在運(yùn)送時讓其處于厭氧環(huán)境下，2-8℃運(yùn)送不超過5 天。另外需要說明的是如弧菌屬和綠膿桿菌需要常溫運(yùn)送，其對2-8℃溫度極其敏感。