本文根據(jù)廣東環(huán)凱微生物科技有限公司儀器廠副廠長駱延平在“中國飲料工業(yè)協(xié)會天然礦泉水分會第十三次會員大會暨技術(shù)交流會”上分享的報告整理而成。

水，是生命之源。近幾年來，在政府的高度重視和各生產(chǎn)廠家的共同努力下，包裝飲用水（包括天然礦泉水）的產(chǎn)品質(zhì)量得到了質(zhì)的提升，但在市場抽檢中不合格產(chǎn)品還是不時的被檢出，主要涉及微生物、理化指標(biāo)、污染物*、界限指標(biāo)等方面，其中因為微生物因素被檢出不合格的占70%以上。本文結(jié)合xin的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 8537-2018和GB 19304-2018，分析飲用天然礦泉水微生物安全監(jiān)控要點和技術(shù)，并分享xin的快速檢測技術(shù)。

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飲用天然礦泉水

微生物安全的主要風(fēng)險

根據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計，2014年至2018年，國家及省級食藥監(jiān)局共檢出2350批次不合格的桶裝水，其中，銅綠假單胞菌被檢出高達(dá)1551次，占比60.8%，成為桶裝水突出的質(zhì)量安全問題。2017一2018年國省抽監(jiān)督礦泉水抽檢的情況（廣東?。嬘锰烊坏V泉水不合格率也達(dá)3.6%。這是由于桶裝水企業(yè)中中小型企業(yè)較多，回收桶存在較多的微生物安全問題，所以桶裝水生產(chǎn)企業(yè)抽檢不合格率較高，從而導(dǎo)致的抽檢不合格率較高。

國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用天然礦泉水中不得添加任何防腐保鮮物質(zhì)，使得其生產(chǎn)過程中的微生物污染控制要求更高；桶裝礦泉水回收桶存在大量微生物，造成清洗消毒比較困難；礦泉水藻類污染相當(dāng)普遍，這些都是礦泉水生產(chǎn)微生物安全的風(fēng)險所在，而這些風(fēng)險又存在于生產(chǎn)過程的所有環(huán)節(jié)。

微生物風(fēng)險主要環(huán)節(jié)

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飲用天然礦泉水

微生物安全監(jiān)控要點

從2019年6月21日起，礦泉水生產(chǎn)企業(yè)實施更嚴(yán)格的飲用天然礦泉水國家標(biāo)準(zhǔn)：GB 19304-2018 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范》和GB 8537-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》 

● 新舊版標(biāo)準(zhǔn)在微生物要求方面的變化

在生產(chǎn)規(guī)范方面，增加了“包裝飲用水加工過程的微生物監(jiān)控程序指南”，為礦泉水生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過程微生物監(jiān)控提供了更具體的指引，但也并未給出具體的參考*，需要企業(yè)根據(jù)實際情況進(jìn)行制定。

在產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)方面，修改了大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的*和采樣方案，要求5份樣品不得檢出。

● 飲用天然礦泉水微生物安全監(jiān)控要點

飲用天然礦泉水微生物安全監(jiān)控是一個整體，貫穿于從水源到生產(chǎn)過程到包裝的全流程。

1、水源的保護(hù)和微生物監(jiān)控是基礎(chǔ)

曾有調(diào)查顯示，檢測福建省77個生產(chǎn)廠家已投入灌裝生產(chǎn)的80處飲用天然礦泉水水源，結(jié)果 80個檢樣中18件水樣檢出銅綠假單胞菌，陽性率22.50％，其檢出率與水源的菌落總數(shù)和大腸菌群無顯著相關(guān)性。廣東省微生物研究所也曾對南方地區(qū)16家礦泉水生產(chǎn)企業(yè)的45份水源水進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示45份水源水中有11份樣品檢出銅綠假單胞菌,陽性率為24.44%。所以，自認(rèn)為礦泉水水源深處地下，對水源的保護(hù)和微生物監(jiān)控不予重視，寄希望于生產(chǎn)過程的后續(xù)殺菌，只會提高生產(chǎn)過程微生物消殺和監(jiān)控的難度，增加成品微生物超標(biāo)的風(fēng)險。

2、 設(shè)備、管道、容器的微生物監(jiān)控

采水設(shè)備、生產(chǎn)設(shè)備、管道、儲水容器、包裝容器等與產(chǎn)品直接接觸的接觸面在每次清洗消毒后都需要進(jìn)行微生物監(jiān)控，以確保不會對產(chǎn)品產(chǎn)生二次污染，接觸面的微生物*可參照成品微生物*的指標(biāo)，重點是要關(guān)注生物膜的形成對接觸面微生物消殺和監(jiān)控的影響。生物膜是一種附著于組織表面、由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外多聚基質(zhì)包裹的有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，由胞外基質(zhì)及被黏連的菌細(xì)胞構(gòu)成。根據(jù)我們的研究，銅綠假單胞菌容易形成生物膜，對外界不利環(huán)境有強(qiáng)烈的抵抗作用，對各種消毒劑不敏感，通透性差，因此形成生物被波的微生物不易被*清除。設(shè)備、管道、容器等不與產(chǎn)品接觸的非接觸面可根據(jù)所處環(huán)境潔凈等級要求進(jìn)行微生物的監(jiān)控，設(shè)備和管道的非接觸面的微生物監(jiān)控可歸類到生產(chǎn)環(huán)境微生物監(jiān)控中。

3、 生產(chǎn)環(huán)境的微生物監(jiān)控

生產(chǎn)環(huán)境的微生物監(jiān)控包含空氣（空間）微生物、人員表面微生物、設(shè)備和管道外表面微生物等的微生物監(jiān)控。在xin國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19304-2018中，只對灌裝防護(hù)區(qū)有具體的潔凈要求，具體的*我們可以參考GB 50687-2011 食品工業(yè)潔凈用房建筑技術(shù)規(guī)范中表4.2.2。

4、 生產(chǎn)過程的微生物監(jiān)控

生產(chǎn)過程中微生物監(jiān)控按GB 19304-2018 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范中的附錄A表A.1參照執(zhí)行。

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飲用天然礦泉水

微生物監(jiān)控技術(shù)

● 監(jiān)控的頻率

水源水：每年豐水期、枯水期各一次，特殊情況增加監(jiān)測次數(shù)；

設(shè)備、管道、容器：每次清洗消毒后；

生產(chǎn)環(huán)境：每次消毒后；

過程水：每周、每兩周或每月一次（根據(jù)實際情況）；

成品水：每批次。

● 微生物監(jiān)控方法

1、水源水、過程水及成品水：依據(jù)GB 8538-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法，采用濾膜法進(jìn)行檢測。濾膜法微生物檢測基本配置：1、不銹鋼多聯(lián)過濾系統(tǒng)；2、無菌濾膜；3、濾膜夾子；4、配套培養(yǎng)基；5、其它實驗室常規(guī)微生物檢測設(shè)備及耗材。

2、設(shè)備、人員、容器等表面微生物監(jiān)控：可參考標(biāo)準(zhǔn)有：2015版中國藥典；GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；GB 14934-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 消毒餐（飲）具；GB 15982-2012 醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；GB/T 18204.4-2013 公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物。歸納起來檢測的主要方法有：

2.1表面沖洗法：適用于監(jiān)測大面積區(qū)域內(nèi)表面的微生物含菌量，包括設(shè)備管道、儲水罐、包裝容器等。

2.2棉簽擦拭法：適用于所有表面微生物采樣，特別適用于不規(guī)則表面。

2.3接觸平皿（接觸碟）法：用于設(shè)備、車間、人員、包裝材料等平整表面的微生物采樣?？扇〈藓灢潦梅?，減少采樣步驟，確保取樣的準(zhǔn)確性和安全性，符合新版GMP標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的采樣要求，在藥企被廣泛使用。

3、空氣微生物監(jiān)控：空氣微生物包括環(huán)境空氣微生物和壓縮空氣（空氣壓縮機(jī)、高壓氣瓶等）的微生物。環(huán)境空氣微生物的監(jiān)控又分為沉降菌和浮游菌的的監(jiān)控。

3.1 沉降菌：通過自然沉降原理收集在空氣中的活微生物粒子，通過的培養(yǎng)基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數(shù)。根據(jù)xin標(biāo)準(zhǔn)GB 19304-2018 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范中附錄規(guī)定，飲用天然礦泉水生產(chǎn)過程中沉降菌的測定標(biāo)準(zhǔn)是采用GB/T 18204.3-2013 公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第3部分：空氣微生物，但飲用天然礦泉水的灌裝防護(hù)區(qū)是潔凈區(qū)，與公共場所的微生物含量差別較大，公共場所的沉降菌檢測方法不適用于礦泉水生產(chǎn)的潔凈區(qū)，建議采用GB/T 16294-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法進(jìn)行檢測。

3.2 浮游菌：用浮游微生物采樣器，收集懸游在空氣中的生物性粒子，通過的培養(yǎng)基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數(shù)。浮游菌的檢測方法可采用GB/T 16293-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法。

3.3 沉降菌和浮游菌的差異：1.沉降菌屬于被動式采樣，浮游菌屬于主動式采樣；2.沉降菌指飄落在地面或物體表面的灰塵中攜帶的微生物；浮游菌指在空氣中漂浮的塵埃所攜帶的微生物；3.浮游菌濃度與沉降菌落數(shù)無線性關(guān)系,沉降菌的檢測不能替代浮游菌的檢測，要全面反映潔凈區(qū)內(nèi)微生物的污染程度,需同時檢測沉降菌和浮游菌兩項指標(biāo)。

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一種水源性致病菌快速檢測技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)，簡稱LAMP技術(shù)，是目前分子檢測手段中操作簡單、靈敏度高、特異性很好的檢測方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

檢測原理：基于遺傳性的DNA或RNA，針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條引物，雙鏈DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)；利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在靶序列兩端引物結(jié)合處循環(huán)不斷產(chǎn)生環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，使得引物在等溫條件下引發(fā)新鏈合成，從而使靶基因擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物會引起指示劑顏色或熒光吸收值變化，從而判讀結(jié)果。

產(chǎn)品應(yīng)用：目前已有商業(yè)化的礦泉水中銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、糞性鏈球菌等檢測的LAMP檢測試劑盒。