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    GB4789.13-2012 食品微生物學(xué)檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗

    發(fā)布時間: 2019-04-03  點(diǎn)擊次數(shù): 2953次

                                                      中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
                                                          GB 4789.13—2012
                                                           食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
                                            食品微生物學(xué)檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗
    中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布
    2012-05-17 發(fā)布2012-07-17 實施
    GB 4789.13—2012
    I
    前言
    本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.13—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗》。
    本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.13—2003 相比,主要變化如下:
    ——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱;
    ——修改了樣品制備過程;
    ——修改了培養(yǎng)基與試劑;
    ——修改了操作步驟;
    ——修改了菌數(shù)計算部分;
    ——增加了附錄A。
    GB 4789.13—2012
    1
    食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
    食品微生物學(xué)檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗
    1 范圍
    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的檢驗方法。
    本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗。
    2 設(shè)備和材料
    除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
    a) 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃;
    b) 冰箱:2 ℃~5℃;
    c) 恒溫水浴箱:50℃±1 ℃,46℃±0.5℃;
    d) 天平:感量0.1 g;
    e) 均質(zhì)器;
    f) 顯微鏡:10×~100×;
    g) 無菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭;
    h) 無菌試管:18mm×180mm;
    i) 無菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm;
    j) pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙;
    k) 厭氧培養(yǎng)裝置。
    3 培養(yǎng)基和試劑
    3.1 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂:見附錄A 中A.1。
    3.2 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG):見附錄A 中A.2。
    3.3 緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基:見附錄A 中A.3。
    3.4 乳糖-明膠培養(yǎng)基:見附錄A 中A.4。
    3.5 含鐵牛乳培養(yǎng)基:見附錄A 中A.5。
    3.6 0.1%蛋白胨水:見附錄A 中A.6。
    3.7 革蘭氏染色液:見附錄A 中A.7。
    3.8 硝酸鹽還原試劑:見附錄A 中A.8。
    3.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液:見附錄A 中A.9。
    4 檢驗程序
    GB 4789.13—2012
    2
    產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗程序見圖1。


    5 操作步驟
    5.1 樣品制備
    5.1.1 樣品采集后應(yīng)盡快檢驗,若不能及時檢驗,可在2 ℃~5 ℃保存;如8 h 內(nèi)不能進(jìn)行檢驗,應(yīng)以
    無菌操作稱取25 g(mL)樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液(液體樣品應(yīng)加雙料),并盡快至于-60 ℃
    低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。
    5.1.2 以無菌操作稱取25 g(mL)樣品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水(如為5.1.1 中冷凍保存樣品,
    室溫解凍后,加入200 mL 0.1%蛋白胨水)的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min~2 min;或
    置于盛有225 mL0.1%蛋白胨水的均質(zhì)杯中,8 000 r/min~10 000 r/min 均質(zhì)1min~2 min,作為1:10 稀釋
    液。
    5.1.3 以上述1:10 稀釋液按1 mL 加0.1%蛋白胨水9 mL 制備10-2~10-6 的系列稀釋液。
    檢樣
    25g(mL)檢樣+225 mL0.1%蛋白胨水
    均質(zhì)、稀釋
    10-1~10-6 稀釋液各1mL + TSC 瓊脂混合
    厭氧培養(yǎng),36℃±1℃、20h~24h,黑色菌落計數(shù)
    任選黑色菌落5 個,分別接種FTG 培養(yǎng)基
    確證試驗
    鏡檢形態(tài) 牛奶發(fā)酵 動力-硝酸鹽 乳糖-明膠
    報告
    GB 4789.13—2012
    3
    5.2 培養(yǎng)
    5.2.1 吸取各稀釋液1 mL 加入無菌平皿內(nèi),每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至50 ℃的TSC
    瓊脂(可放置于50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫)15 mL,緩慢旋轉(zhuǎn)平皿,使稀釋液和瓊脂充分混勻。
    5.2.2 上述瓊脂平板凝固后,再加10 mL 冷卻至50 ℃的TSC 瓊脂(可放置于50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱
    中保溫)均勻覆蓋平板表層。
    5.2.3 待瓊脂凝固后,正置于厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi),36 ℃±1 ℃培養(yǎng)20 h~24 h。
    5.2.4 典型的產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC 瓊脂平板上為黑色菌落。
    5.3 確證試驗
    5.3.1 從單個平板上任選5 個(小于5 個全選)黑色菌落,分別接種到FTG 培養(yǎng)基,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)
    18 h~24 h。
    5.3.2 用上述培養(yǎng)液涂片,革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌,有
    時可見芽孢體。如果培養(yǎng)液不純,應(yīng)劃線接種TSC 瓊脂平板進(jìn)行分純,36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)20 h~24 h,
    挑取單個典型黑色菌落接種到FTG 培養(yǎng)基,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h~24 h,用于后續(xù)的確證試驗。
    5.3.3 取生長旺盛的FTG 培養(yǎng)液1 mL 接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基,在46 ℃±0.5 ℃水浴中培養(yǎng)2 h 后,每
    小時觀察一次有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象,該現(xiàn)象的特點(diǎn)是乳凝結(jié)物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì),通常會上
    升到培養(yǎng)基表面。5 h 內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)酵乳糖,凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣,呈“暴烈發(fā)
    酵”現(xiàn)象,但培養(yǎng)基不變黑。
    5.3.4 用接種環(huán)(針)取FTG 培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基,于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h。在透
    射光下檢查細(xì)菌沿穿刺線的生長情況,判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴(kuò)散生長,無動力的菌
    株只沿穿刺線生長。然后滴加0.5 mL 試劑甲和0.2 mL 試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。15 min 內(nèi)出現(xiàn)紅
    色者,表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽;如果不出現(xiàn)顏色變化,則加少許鋅粉,放置10 min,出現(xiàn)紅色者,
    表明該菌株不能還原硝酸鹽。產(chǎn)氣莢膜梭菌無動力,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
    5.3.5 用接種環(huán)(針)取FTG 培養(yǎng)液穿刺接種乳糖-明膠培養(yǎng)基,于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。
    如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅變黃,表明乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。將試管于5 ℃左右放置1 h,檢查明膠液化情況。
    如果培養(yǎng)基是固態(tài),于36 ℃±1 ℃再培養(yǎng)24 h,重復(fù)檢查明膠是否液化。產(chǎn)氣莢膜梭菌能發(fā)酵乳糖,使
    明膠液化。
    6 結(jié)果與報告
    6.1 典型菌落計數(shù)
    選取典型菌落數(shù)在20 CFU~200 CFU 之間的平板,計數(shù)典型菌落數(shù)。如果:
    a) 只有一個稀釋度平板的典型菌落數(shù)在20CFU~200CFU 之間,計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落;
    b)低稀釋度平板的典型菌落數(shù)均小于20 CFU,計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落;
    c)某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于200 CFU,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,應(yīng)計數(shù)該稀
    釋度平板上的典型菌落;
    d)某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于200 CFU,且下一稀釋度平板上有典型菌落,但其平板上的
    典型菌落數(shù)不在20 CFU~200 CFU 之間,應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落;
    e)2 個連續(xù)稀釋度平板的典型菌落數(shù)均在20CFU~200CFU 之間,分別計數(shù)2 個稀釋度平板上的典
    型菌落。
    6.2 結(jié)果計算
    6.1 計數(shù)結(jié)果按公式(1)計算:
    GB 4789.13—2012



    式中:
    T——樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù);
    A——單個平板上典型菌落數(shù);
    B——單個平板上經(jīng)確證試驗為產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落數(shù);
    C——單個平板上用于確證試驗的菌落數(shù);
    n1 ——稀釋度(低稀釋倍數(shù))經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個數(shù);
    n2 ——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個數(shù);
    0.1——稀釋系數(shù);
    d——稀釋因子(稀釋度)。
    6.3 報告
    根據(jù)TSC 瓊脂平板上產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型菌落數(shù),按照6.2 中公式計算,報告每g(mL)樣品中產(chǎn)
    氣莢膜梭菌數(shù),報告單位以CFU/ g(mL)表示;如T 值為0,則以小于1 乘以低稀釋倍數(shù)報告。

    GB 4789.13—2012
    5
    附錄A
    培養(yǎng)基和試劑
    A.1 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂
    A.1.1 基礎(chǔ)成分
    胰胨15.0 g
    大豆胨5.0 g
    酵母粉5.0 g
    焦亞硫酸鈉1.0 g
    檸檬酸鐵銨1.0 g
    瓊脂15.0 g
    蒸餾水900.0 mL
    pH 7.6±0.2
    A.1.2 D-環(huán)絲氨酸溶液
    溶解1 gD-環(huán)絲氨酸于200 mL 蒸餾水,膜過濾除菌后,于4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?br />A.1.3 制法
    將基礎(chǔ)成分加熱煮沸至*溶解,調(diào)節(jié)pH,分裝到500 mL 燒瓶中,每瓶250 mL,121 ℃高壓滅菌
    15 min,于50 ℃±1 ℃保溫備用。臨用前每250 mL 基礎(chǔ)溶液中加入20 mL D-環(huán)絲氨酸溶液,混勻,傾注
    平皿。
    A.2 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)
    A.2.1 成分
    胰蛋白胨15.0 g
    L-胱氨酸0.5g
    酵母粉5.0 g
    葡萄糖5.0 g
    氯化鈉2.5g
    硫乙醇酸鈉0.5g
    刃天青0.001g
    瓊脂0.75g
    蒸餾水1 000.0 mL
    pH 7.1±0.2
    A.2.2 制法
    將以上成分加熱煮沸至*溶解,冷卻后調(diào)節(jié)pH,分裝試管,每管10 mL,121 ℃高壓滅菌15 min。
    臨用前煮沸或流動蒸汽加熱15 min,迅速冷卻至接種溫度。
    A.3 緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基
    A.3.1 成分
    蛋白胨5.0 g
    牛肉粉3.0 g
    硝酸鉀5.0 g
    磷酸氫二鈉2.5g
    GB 4789.13—2012
    6
    半乳糖5.0 g
    甘油5.0 mL
    瓊脂3.0 g
    蒸餾水1 000.0 mL
    pH 7.3±0.2
    A.3.2 制法
    將以上成分加熱煮沸至*溶解,調(diào)節(jié)pH,分裝試管,每管10 mL,121 ℃高壓滅菌15 min。如果
    當(dāng)天不用,置4 ℃左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱15 min,迅速冷卻至接種溫度。
    A.4 乳糖-明膠培養(yǎng)基
    A.4.1 成分
    蛋白胨15.0 g
    酵母粉10.0 g
    乳糖10.0 g
    酚紅0.05g
    明膠120.0 g
    蒸餾水1 000.0 mL
    pH 7.5±0.2
    A.4.2制法
    加熱溶解蛋白胨、酵母粉和明膠于1000 mL 蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH,加入乳糖和酚紅。分裝試管,每
    管10 mL,121 ℃高壓滅菌10 min。如果當(dāng)天不用,置4 ℃左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱
    15 min,迅速冷卻至接種溫度。
    A.5 含鐵牛乳培養(yǎng)基
    A.5.1 成分
    新鮮全脂牛奶1 000.0 mL
    硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 1.0 g
    蒸餾水50.0 mL
    A.5.2 制法
    將硫酸亞鐵溶于蒸餾水中,不斷攪拌,緩慢加入1000 mL 牛奶中,混勻。分裝大試管,每管10 mL,
    118 ℃高壓滅菌12 min。本培養(yǎng)基必須新鮮配制。
    A.6 0.1% 蛋白胨水
    A.6.1 成分
    蛋白胨1.0 g
    蒸餾水1 000.0 mL
    pH 7.0±0.2
    A.6.2制法
    加熱溶解,調(diào)節(jié)pH,121 ℃高壓滅菌15 min。
    A.7 革蘭氏染色液
    A.7.1 結(jié)晶紫染色液
    A.7.1.1 成分
    結(jié)晶紫1.0g
    GB 4789.13—2012
    7
    95%乙醇20.0 mL
    1%草酸銨水溶液80.0 mL
    A.7.1.2 制法
    將結(jié)晶紫*溶于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
    A.7.2 革蘭氏碘液
    A.7.2.1 成分
    碘1.0 g
    碘化鉀2.0 g
    蒸餾水300.0 mL
    A.7.2.2 制法
    將碘與碘化鉀先混合,加入蒸餾水少許振搖,待*溶解后,再加入蒸餾水至300 mL。
    A.7.3 沙黃復(fù)染液
    A.7.3.1 成分
    沙黃0.25 g
    95%乙醇10.0 mL
    蒸餾水90.0 mL
    A.7.3.2 制法
    將沙黃溶解于95%乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
    A.7.4 染色方法
    涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染色1 min,水洗。滴加革蘭氏碘液,作用1 min,水洗。滴
    加95%乙醇脫色約15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。滴加沙黃復(fù)染液,復(fù)染1 min,
    水洗、待干、鏡檢。
    A.8 硝酸鹽還原試劑
    A.8.1 甲液(對氨基苯磺酸溶液)
    在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解8 g 對氨基苯磺酸。
    A.8.2 乙液(α-萘酚乙酸溶液)
    在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解5 g α-萘酚。
    A.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液
    A.9.1 成分
    甘油100.0 mL
    氯化鈉4.2 g
    磷酸氫二鉀(無水) 12.4 g
    磷酸二氫鉀(無水) 4.0 g
    蒸餾水900.0 mL
    pH7.2±0.1
    A.9.2 制法
    將以上成分加熱至*溶解,調(diào)節(jié)pH,121 ℃高壓滅菌15 min。配制雙料緩沖甘油溶液時,用甘油
    200 mL和蒸餾水800 mL。

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